磷酸化蛋白质组的研究工具[选购宝典]

可逆的蛋白磷酸化是最重要的翻译后修饰之一，也是研究的热点。磷酸化调控了细胞进程，包括细胞周期、生长、凋亡以及信号转导通路的关键事件。为了更好地了解这种调控机制的分子基础，研究人员常常需要鉴定蛋白的磷酸化位点。

赛默飞世尔科技旗下的蛋白质专家Pierce提供了一整套磷酸化蛋白质组的研究工具，包括纯化、富集和检测。蛋白磷酸化的检测可不是件容易的事，因为磷酸基团相当不稳定。磷酸化蛋白的低丰度也让检测难度陡增，并且市场上磷酸化特异抗体的选择也不多。

对于磷酸化蛋白的富集，目前有多种方法。对于选择性富集，常借助于磷酸化抗体来进行免疫沉淀。近来出现了一种新方法，就是利用金属螯合层析（IMAC）富集磷酸化蛋白，并结合质谱分析，大大提高了磷酸化蛋白质组的分辨率。金属螯合层析也是一种很有效的方法，它利用了磷酸基团与某些金属（如镓）的亲和力。二氧化钛层析是一种相对较新的技术，它通量高，柱准备时间也少得多。

磷酸化蛋白的富集
Pierce Phosphoprotein Enrichment Kit能够从哺乳动物细胞裂解液和组织提取物中高效富集磷酸化蛋白。此试剂盒采用方便的离心柱形式，简单快速，整个富集过程仅需1.5-2小时。独特的树脂和缓冲液配方让产量更高，而非特异结合几乎可忽略。此试剂盒与多种下游应用兼容，包括质谱分析、Western blotting、蛋白芯片和双向电泳。产量一般为上样总蛋白的10-25%，不过这只是概括而言，细胞类型以及处理方式都会影响产量。注意：磷酸化蛋白的结合取决于蛋白等电点和缓冲液的pH值，必要的时候，你需要调整一下缓冲液的pH。

磷酸化肽段分离
从复杂的蛋白裂解液中鉴定特定的磷酸化肽段是很有挑战性的。非目标肽段的去除对于简化下游鉴定过程很重要。Phosphopeptide Isolation Kit采用易用的离心柱形式，让磷酸基团与固定的镓结合。每个镓圆盘可结合大约150 μg的磷酸化肽段。整个操作过程十分快速，仅需15分钟。纯化后的磷酸肽段可用经典方法分析（比如薄层层析、高压液相色谱等），也可交给更高通量的LC-MS和MALDI-MS分析。操作手册中提到了多种结合、洗涤和洗脱缓冲液，适合不同的应用。比如，在碱性条件下（如0.1N 碳酸氢铵）来洗脱磷酸化肽段后，下游可直接用质谱分析，而无需额外的样品处理。

高通量的磷酸化肽段分离
Pierce Magnetic Titanium Dioxide Phosphopeptide Enrichment Kit适合于复杂样品的高通量纯化。TiO2配体选择性结合含有磷酸化丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的肽段，而与酸性残基的非特异性结合极少，能够从蛋白酶消化的样品中富集磷酸化肽段。TiO2包被的磁珠可用于高通量的磁性平台，如Thermo Scientific KingFisher 96和Flex仪器，当然也能用于普通的台式操作。试剂盒中附带了两个Thermo-Fast 96 Robotic PCR Plate，一次能处理1-96个样品，如果用KingFisher Flex仪器分析，整个过程只需要15分钟。此方法比传统的IMAC灵敏1000倍以上，能富集100 fmol的磷酸化蛋白。

酪氨酸磷酸化蛋白的捕获
大家都知道，蛋白磷酸化指的是丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的磷酸化。尽管在所有磷酸化事件中，酪氨酸的磷酸化只占了0.1-1%，但却是研究最多的，因为磷酸化酪氨酸信号的调控异常与多种人类疾病有关。包含SH2结构域的蛋白能够识别许多信号蛋白的特定磷酸化酪氨酸残基，并调节酪氨酸激酶的功能。

Pierce的SH2 Domain Phosphotyrosine Capture Kit就利用这一特性，能从哺乳动物的细胞裂解液中纯化具有活性的酪氨酸磷酸化蛋白。分析过程采用带GST标签的SH2结构域肽段及谷胱甘肽琼脂糖树脂来捕获特定的结合物，代替了传统的磷酸化抗体所进行的免疫沉淀。它能以非肽段的形式，鉴定全长的内源蛋白。SH2 Domain Phosphotyrosine Capture Kit让研究人员能监控特定的酪氨酸磷酸化事件，并鉴定SH2结构域蛋白-蛋白相互作用网络。纯化产物可用Western blot或质谱进行分析。
每个试剂盒中含有600 μg GST-SH2结构域和足量的试剂（包括阴性对照），能够进行6次pull-down反应，每次约500 μg细胞裂解液。针对不同的蛋白，有不同的捕获试剂盒，详细信息可向赛默飞世尔索取。

丝氨酸、苏氨酸磷酸化蛋白的检测
至于丝氨酸、苏氨酸磷酸化蛋白的检测，Phosphoprotein Phosphate Estimation Assay Kit是一种简便易用的方法，能快速确定纯化蛋白的磷酸化水平。在分析过程中，先将丝氨酸和苏氨酸残基上的磷酸碱性水解，再利用孔雀石绿和钼酸铵定量释放的磷酸。这种方法能够鉴定出包含磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸的未知蛋白，并确定其磷酸化的程度。纯化的蛋白样品再与特定浓度的卵黄高磷蛋白（phosvitin）标准品进行比较，其中卵黄高磷蛋白的磷酸化水平已知，来计算每摩尔纯化蛋白的磷酸摩尔数。分析可在EP管中进行，若追求高通量，也可以在微孔板上进行。

若想在SDS-PAGE胶上对磷酸化蛋白进行特异染色，Pierce Phosphoprotein Staining Kit可以实现。在钙离子存在的情况下，0.5 N NaOH能水解磷脂键。凝胶中新形成的磷酸钙用钼酸铵处理，产生不溶的硝基磷酸-钼酸盐复合物，最后用甲基绿进行染色。整个过程大约需要三个小时，不过就流程来看，似乎不如生物通最近介绍的Pro-Q Diamond染料更方便。

除了上面介绍的这些试剂盒，Pierce还提供了300多种磷酸化特异抗体，应用于免疫荧光、高内涵分析、ELISA、免疫沉淀、Western blot等多个领域。详细的抗体列表可查看Pierce的目录，或向赛默飞世尔索取。（生物通 余亮）